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进口流式细胞仪操作规程

2012-06-05  点击量:

                                                   来源:复旦大学分子病毒学实验室
 

目的:流式细胞仪开机程序、预设获取模式文件、设定和调整、样品分析、关机程序
  一.开机程序
  1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
  2.打开储液箱,倒掉废液,
  并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。
  3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。
  4.如果需要打印,打开打印机电源。
  5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
  6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。
  7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
  做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。

  二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
  1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
  2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot
  Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。
  3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。
  4.将此视窗命名后储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder
  EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。
  本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest
  EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。

  三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整
  1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
  2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键: +B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton
  Control对话框移至合适位置。
  3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用
  +1,2,3,4获得此四个对话框。
  4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier
  mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDM
  Param选择FL2,而FL1,
  FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDM
  Param选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量。
  5.放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上。
  6.在Acquisiton
  Control对话框中,选取Acquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
  7.在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMT voltages(粗调)与Amp
  Gains(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
  8.在Threshold
  对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量。
  9.从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
  10.Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3,
  FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内。
  11.在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2-
  的细胞群却分布在FL1+ FL2+区域内,则需调大FL2-?%FL1中的“?”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
  12.在Status对话框中可见:Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW;Laser
  current:正常值为6Amps左右。
  13.调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可。
  本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 BD Applications CELLQuest Folder
  IMM-InstrSettings及FACStation G3 BD Files Instrument Settings Files
  CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞

  四.通过预设的获取模式文件进行样品分析
  1.从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件。
  2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton
  Control对话框移至合适位置。
  3.从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set 确定。
  4.在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024。Parameter
  Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
  5.在Acquire指令栏中,选择Parameter
  Description,以决定文件存储位置(folder),文件名称(file),样品代号以及各种参数的标记(panel),即安排tube1,2,3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation
  G3BD Applications CELLQuest IMM 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。
  6.在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数。
  7.将样品试管放至检测区,在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
  8.微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort,
  去除Setup前的“”,开始正式获取信号,存储数据。
  9.当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据。重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕。
  当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管。

  五.关机程序:
  1.从File中选择Quit, 退出软件,选择Don’t Save至苹果屏幕。
  2.用4ml 1:10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位(vacuum is on),以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位(vacuum is
  off),再HIGH RUN 5分钟(内管吸去2ml)。
  3.改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
  4.按Prime三次。
  5.此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态
  10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行。
  6.填写使用登记表。

流式细胞仪主要技术指标
  
  1.流式细胞仪的分析速度:
  一般流式细胞仪每秒检测1000~ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞

  2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。

  3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。

  4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

     5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。
  
TEL:4007000101

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