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免疫细胞化学(ICC)的原理及操作

2012-06-19  点击量:

【原理】免疫细胞化学技术的原理是:把组织中的特异分子作为抗原,用各种在显微镜下可见的标记物标记特异抗体或标记抗原抗体复合物,使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞细胞器水平定位特异分子的目的。

【步骤】SP法的基本步骤

1. 石蜡切片,常规脱蜡至水

2. 3%的过氧化氢去离子水孵育5-10min,消除内原性过氧化物酶。蒸馏水冲洗。

3. 抗原修复:微波热修复,取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0)于微波盒中,微波加热至沸腾将脱蜡水化后的切片放入已沸腾的缓冲液中,中继续处理10~15 min取出微波盒,冷却至室温取出玻片。先用蒸馏水洗2次,后用PBS5min0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g,加蒸馏水至1000ml

4. 封闭:滴加正常山羊血清封闭液室温10~20 min甩去多余液体,勿洗

5. 滴加适当稀释的一抗,37 2-3H4过夜。

6. PBS冲洗,3分钟×3

7. 滴加生物素化二抗37孵育10-15min

8. PBS冲洗,3分钟×3

9. 滴加辣根酶标记链酶卵白素,室温或37孵育10-15min

10. PBS冲洗,3分钟×3

11. AEC/DAB显色

12. 蒸馏水反复洗涤后,甘油明胶封片。甘油明胶:明胶 40g、甘油 250ml、蒸馏水 210ml、石炭酸 5ml,混匀,过滤。

13. 微图象分析:取处理组和对照组各2张免疫组织化学的玻片,每张玻片随机取5个视野,OLYMPUS IX70倒置显微镜下观察,KODAK数码相机拍照记录。捷达形态学图象分析系统分析记录图片的总IOD值。

 免疫细胞化学技术    标记物     抗原抗体复合物

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