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    • PCR仪 实时荧光定量PCR

      点击量:13   福生更新于2017-08-22

      实时荧光定量PCRPCR(PolymeraseChainReaction),即多聚核苷酸链式反应是最基础的一种核酸扩增方法。而实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR,简称qPCR)是在从PCR基础上发展起来的、功能强大的多的一种在DNA扩增的同时可以实时检测核酸产物的方法。它用荧光化学物质对PCR进程进行实时检测,得到每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过与同时被测量的参考DNA浓度的比较,定量计算出待测基因的浓度。从仪器的技术含量角度看,qPCR仪,即实时荧光定量PCR仪技术及制造难度比PCR仪高的多,仪器的价值同样也高得多。检测方法1.SYBRGreenⅠ法:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图,PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)。2.TaqMan探针法:探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。技术原理以TaqMan探针法为例,SYBRGreenⅠ法除不需要特异性荧光探针外,DNA扩增原理与TaqMan探针法一样。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。Ct值Ct值(Cyclethreshold,循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。1.荧光阈值(threshold)的设定阈值设定方法有多种,例如,用PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold=10*SDcycle3-152.Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数,X0为初始模板量,Ex为扩增效率,N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光化学物质实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两类:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:1.TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2.SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合,因此可以通过熔解曲线,确定PCR反应是否特异。3.分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近,不会产生荧光。PCR产物生成后,退火过程中,分子信标中间部分与特定DNA序列配对,荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。传统定量PCR1.传统定量PCR方法简介1)内参照法:在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3)PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。2.内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终点产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3.内标对定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。实时荧光定量PCR的定量方法在Real-timePCR中,模板定量有两种策略,相对定量和绝对定量。相关应用临床疾病诊断各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断;精准医疗方面的液体活检。个人健康风险预测,如II糖尿病、心脏病、老年痴呆症、过敏、合适化妆品的使用,乃至饮食习惯、生活方式调整来降低或避免自身基因问题未来可能产生的疾病的隐患。动物疾病检测禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。食品及中药材安全及真伪鉴别食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌的检测、各种肉类真假、珍惜中药材等的真伪鉴别。科学研究医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。应用行业各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

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    • 冷冻干燥机 实验室冻干机技术方案

      点击量:3   Telstar更新于2017-09-06

      技术参数(LYOQUEST-55型号冻干机)一、冷凝器1、冷肼容积≥10L,材质:316L不锈钢*2、冻干能力:24小时捕冰量:5kg/24小时,总捕冰能力:8kg3、超大内表面积:0.25㎡4、可电加热除霜二、制冷系统1、压缩机数量:1个单级进口压缩机,室温21℃下,制冷温度-55摄氏度。2、制冷功率(at-35ºC):495W3、制冷剂(freeofCFCs):R-507无氟环保制冷剂4、制冷类型:风三、真空系统1、极限真空度:2×10-4mbar*流速(50Hz)≥6m3/h(100L/min)外形尺寸(宽/深/高)≤165/350/240mm重量≤16kg功率:250W2、气密性:可做真空泄漏率测试,出厂测试标准为<0.020mbarliters/second(0.002par.m3/秒)3、系统真空度可控:真空泵和冷阱之间配电磁阀,用于冻干过程中控制系统真空度。4、真空泵的保护:PLC控制系统中,用户可自行设置真空泵启动温度。确保真空泵启动时,冷阱内无液体。以确保液体不会进入到真空泵的润滑油中。*5、真空泵配真空泵油止逆阀。防止真空泵油倒吸。四、控制系统1、稳定、智能化、便于操作的PLC控制系统+触摸屏操控系统2、液晶大屏幕显示重要过程参数:冷凝器温度、层板温度、产品温度、系统真空度、过程时间、报警信息等;*3、可设置冻干配方:5个冻干配方,每个配方可设置10个步骤。一次冻干及二次冻干一共可设置至少9个步骤;*4、半自动模式、全自动模式两种操作模式可选;5、可设置真空度启动温度,只有当冷阱降温到预设温度后真空泵才启,确保无液体进入真空泵;6、可自动开机。运行过程中如果发生意外断电,冻干机会自动保存冻干程序数据,并在检测到电力恢复之后自动开机继续运行未完成的冻干程序;*7、系统具有声光报警功能,系统出现任何异常都会自动报警,且自动判断故障原因,并在屏幕上以数字形式告知用户报警原因;*8、配置冻干软件,连接至电脑可生成冻干曲线及保存冻干数据。标准配置包含RS232接口。五、腔体(标准干燥腔)1、包含至少三个铝制层板;2、层板材质:铝;*3、非镀黑材料,耐用易清洁;4、有机玻璃干燥腔,带防爆膜,密封圈无需真空脂;*5、标准腔体可放入冷阱内,进行样品预冻。6、具有两种冻干方式:冷凝室里面冻干,冷凝室上面冻干;*7、标准腔体尺寸≥Ф215*300mm;托盘尺寸≥Ф160mm;总冻干面积≥0.075㎡;8、层板间距≥70mm;9、冷凝管位于冷凝室外部,便于冷凝室清洁,避免清洁过程对冷凝管的损坏。六、配置:1、冷冻干燥机主机1台;2、铝制三层隔板1套;3、有机玻璃干燥腔1个;4、真空泵1台及真空泵连接管1套,含法兰接口;5、真空泵油雾过滤器1个;6、底板1个;7、真空传感器及连接件1套;8、真空控制阀1个;9、真空管及配套标准法兰1套;10、电磁阀1个及法兰连接件;11、真空泵油1桶;

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    • 食品安全检测 重金属污染的严重性到底有多可怕?

      点击量:5   宝亚奇更新于2017-06-07

      重金属污染的严重性到底有多可怕?一、土壤重金属污染土壤污染问题已经成为继大气污染、水污染之后引起全社会高度关注、急需解决的重大环境问题。有关数据显示,我国严重土壤污染区就达320个,约548万公顷。此外,我国至少还有近3000万公顷的污染土地,包括接近2000万公顷耕地受重金属污染,500万公顷土地受石油污染,200万公顷土地受矿区污染,5万公顷土地受固体废弃堆放污染。由此可见,土壤重金属污染问题尤为突出。关于重金属污染事件屡见不鲜,从湖南儿童血铅超标事件,陕西凤翔数百儿童铅超标到重金属污染“菜篮子”等等,南方周末曾报道说,饮水机内也存在重金属污染,可见重金属污染已影响到我们的生活环境。日常生活中重金属多通过大气、水和食物进入人体,从而引起人体的慢性中毒。对人体危害最大重金属的是铅、汞、镉、铬、砷五种。这几种重金属生物毒性显著,在水中不能被分解,人体摄入后毒性放大,与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物。其中铅是重金属污染中毒性较大的一种,一旦进入人体将很难排除,能直接伤害人的脑细胞,特别是胎儿的神经系统,;汞食入后直接沉入肝脏,对大脑、神经、视力破坏极大;镉导致高血压,引起心脑血管疾病;过量摄入铬会造成肾脏、肝肝脏、神经系统和血液的广泛病变,导致死亡;砷是砒霜的组分之一,有剧毒,有致癌性。二、我司的检测手段随着土壤污染问题的凸显,国家对于土壤的修复治理也更为重视。2016年5月31日,历经3年时间起草,5次征求中央及国务院有关部门和单位意见,3次征求各省区市人民政府意见,50易其稿的《土壤污染防治行动计划》(业内简称“土十条”)发布。土壤污染成今年两会热门议题。今年的政府工作报告中,李克强总理提到要“开展土壤污染详查”,摸清土壤污染的“家底”,才能采取针对性措施。我公司(北京宝亚奇仪器有限公司)响应国家政府部门的号召,积极加入土壤污染的检测治理队伍中,为中国土壤污染的修复治理工作出一份力。我公司坐落于北京市海淀区长安街沿线万寿路西街文博大厦,是一家经国家发改委立项、环保局审批的专业从事农业仪器研发、生产和销售的高新科技型企业。我公司专业从事土壤肥料养分速测仪、土壤重金属检测仪、农药残留速测仪、综合食品安全检测仪、土壤墒情速测仪、植物病害诊断仪、叶绿素速测仪、虫情测报灯、孢子捕捉器、病虫调查统计器、杀虫灯、粘虫板、气象站等农业仪器的研发、生产、销售,并相继开发、完善了测土配方施肥监测系统、食品安全监测系统、土壤墒情监测系统、农业气象监测系统、植保物联网监测系统、病虫害预测预警系统、病虫害查询系统等现代农业物联网智能测控系统。国内通常认可的重金属分析方法有:紫外可分光光度法(UV)、原子吸收法(AAS)、原子荧光法(AFS)、电感耦合等离子体法(ICP)、X荧光光谱(XRF)、光谱法,日本和欧盟有的国家应用电感耦合等离子质谱法(ICP-MS),但仪器成本太高,不适合于国内用户。我司对于土壤重金属检测和食品重金属检测和蔬菜种金属检测针对性的研发了检测仪器,运用了朗伯-比尔定律,又称比尔定律、比耳定律、朗伯-比尔定律(Beer-LambertLaw)、布格-朗伯-比尔定律,也就是紫外可见分光光度法(UV),用一定的浸提液浸提待测物质中的待测元素,有效元素进入溶液中,溶液中的元素可与特定的显色剂反应,生成有色溶液,溶液颜色的深浅与重金属的含量成正比。即:A=K*C*L式中:A:吸光度K:吸收系数C:溶液浓度L:溶液厚度由上式可得:C=A/KL,设待测溶液浓度为C2,则当K、L相同时C2=A2/A1*C1式中A2/A1可由仪器内部测知C1为标准溶液浓度,当输入C1数据后,仪器可自动计算并显示C2的值。BY-B4土壤重金属检测仪的性能特点:1、采用微处理器技术、数字化线路、程序化设计、单片机控制、触摸式按键、液晶显示。2、交、直(车载)两用。3、采用滤光片作为光源,硅半导体作为信号接收系统,寿命长达10万小时。4、暗盒部分采用双多光路机构设计,避免了不同通道产生的系统误差。5、工作稳定性优于国家标准JJG179-90指标的6倍,重复性达到光栅型分光光度计指标。6、对有效磷的测试有温度自动校正功能。7、内置热敏打印机,存储打印测试结果。技术参数:1、量程及分辨率:0.001~9999;2、稳定性:3min内漂移小于0.003;3、线性误差:>0.003;4、重复性误差:>0.005;5、灵敏度:红光≥4.5×10-5蓝光≥3.17×10-3绿光≥2.35×10-3橙光≥2.13×10-3;6、波长范围:红光:680±2nm;蓝光:420±2nm;绿光:510±2nm;橙光:590±2nm;7、PH值(酸碱度)测量技术参数:A、测试范围:1~14B、误差:±0.1;8、本仪器所用电源:A、交流电:180V~240V、50HzB、直流电:12V、5W(车载);9、测试速度:测一个土样(N、P、K)≤30分钟同时测5个土样≤50分钟;10、抗震性:合格仪器配置(铝合金密码箱两个:490×305×165mm,净重10Kg)1、仪器箱:主机、电子天平、比色皿、通讯软件、通讯线、移液器等。2、药品箱:三角瓶、容量瓶、漏斗、量筒、反应瓶、铝盒、洗瓶、药品1套等。配套齐全,仪器集药、器、仪为一体,携带方便,相当于一个小型实验室,操作简单,耗时短,成本低。三、重金属污染的治理及前景我国对于重金属污染的治理整体来说还不是很理想,2014年4月,国家环保部和国土资源部共同开展的首次全国土壤污染状况调查结果显示,全国土壤环境状况总体不容乐观。专家预测从2014年至2020年,国内土壤修复市场规模可达6856亿元。由此可见,我国改革开放以来各行业对土壤的污染已严重到何种地步。2017年4月,农业部科技发展中心主持开展了国家重点研发计划“农业面源和重金属污染农田综合防治与修复技术研发”重点专项2017年度申报项目评审,方向就是农田氮磷径流流失污染与防控机制、农业废弃物资源化利用机制、设施农业氮磷污染负荷削减技术与产品研发、水土流失型氮磷面源污染阻截技术与产品研发、小麦玉米主产区氮磷淋失阻控技术与产品研发、农田有毒有害化学/生物污染防控技术与产品研发、农业废弃物厌氧发酵及资源化成套技术与设备研发、农业面源和重金属污染检测技术设备研发及标准研制。重金属污染是众多污染源中的一部分,对于食品安全和土壤安全,近年来国内部分企业,提出了“智慧农业”的概念。从土壤的检测,气象的检测,病虫害的检测,农作物的检测等,形成一条完整的“农业物联网”。这样不论是政府监管部门还是超市、消费者,都可以查看到产品从原材料到成品中间的每一个环节的状况,从而实现绿色食品的透明化,减少对人体不利的健康影响因素。我们坚信随着人们对类似重金属污染的重视,加上我公司这样的环保企业及众多环保人士的积极参与,土壤问题将慢慢得以解决,环境治理的步伐将更快,人们的生活环境将会更加和谐。

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